cdna是指互补DNA。
cdna简介:
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写,或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成。
并且在合成单链cDNA后,在用碱处理除去与其对应的RNA以后,以单链cDNA为模板,由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。
cdna重组:
①借助于末端转移酶的3’—OH端合成均聚物的能力,双链cDNA和线性化载体DNA的3’—OH端分别加上均聚核苷酸链。
②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平,然后用T4 DNA连接酶进行齐头连接,形成重组体。
③通过粘性末端连接。
转化:
重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时,整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因,这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。
cdna双链合成:
cDNA第一链的合成:
用亲和层析法得到mRNA后,根据mRNA分子的3’端有poly(A)尾结构的原理,用12—20个核苷酸长的oligo(dT)与纯化的mRNA混合,oligo(dT)会与poly(A)结合作为反转录酶的引物,反转录反应的产物是一条RNA—DNA的杂交链。
Oligo(dT)结合在mRNA的3’端,因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端,有时这种全合成难以达到,尤其是mRNA链很长时,为此建立了一种随机引物法合成cDNA。
cDNA第二链的合成:
利用cDNA第一链的3’末端常常出现发夹环的特征,这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果,它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环,可以用单链特异的S1核酸酶切去。
但是S1核酸酶的处理,常常会“修剪”过多的cDNA顺序,使cDNA丢失了mRNA 5’端的部分顺序。
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